MALDI成像在跨学科研究中的应用:从代谢组学到杀虫剂
2019/04/29
用MALDI成像技术着重研究诸如十氯酮等杀虫剂如何长期影响人类健康,并在补救和环境政策的立法、政治和经济决策提供支持性证据。

摘要

基质辅助激光解吸/电离(MALDI)成像质谱法能以直接、原位、无标记的方式测量组织中的蛋白质、多肽、脂质、小分子药物及其代谢物和其它化合物。应用范围覆盖基础生物学研究、环境和毒理学科学,以及专门的药物研发方法。在各种情况下,MALDI成像所产生的独特信息对理解包括人、动物和植物等各类生命体的各种重要因素,如分子和代谢机制,以及化合物或代谢物转运和定位,都能作出重要贡献。本文将用MALDI成像技术着重研究诸如十氯酮等杀虫剂如何长期影响人类健康,并在补救和环境政策的立法、政治和经济决策提供支持性证据。

介绍

在过去十年中,对高灵敏度、超快速质谱技术的需求激增,推动了一系列的质谱仪的创新,并将其应用扩展到了更多的领域,包括药物研发、OMICS 研究、药物代谢和环境科学。现在,质谱仪在传统分析实验室之外很常见,不同的电离源——如直接基质辅助激光解吸/电离(MALDI)——的出现推动了蛋白质组学和质谱成像的诸多进展。

MALDI成像——20世纪90年代末,Caprioliet 等[1] 首次强调这项技术,作为研究哺乳动物组织切片中生化过程的高灵敏度工具,对分子生物学领域,特别是在研究包括人类、动植物在内的生物系统中化合物和代谢物的转运和定位方面,做出了重大贡献。

集成生物学与化学

MALDI成像能以直接、原位、无标记的方式测量组织中的蛋白质、多肽、脂质、小分子药物及其代谢物和其它化合物。Caprioliet等的早期实验展示了对大鼠胰腺和垂体区域的MALDI离子图像分析。一些多肽只在局部棋牌游戏可以赚钱吗到。同时,作者还注意到,在大鼠垂体组织的一副质谱图上,棋牌游戏可以赚钱吗到超过50个相互关联的离子,,他们均为某一个多肽的前体、亚型和代谢碎片。

最近,Journal of Proteomics(《蛋白质组学杂志》)发表了一篇综述文章,介绍了MALDI成像在环境污染物毒理学评价中的潜力。作者的结论是,MALDI成像在研究释放到环境中的化学物质的分布和代谢,以及更好地阐明其作用机制方面具有巨大的潜力。

根据应用需要,可以将一系列质谱仪集成到MALDI成像系统中。例如,MALDI-Time-of-Flight(TOF)系统可提供高通量(对分子量类似的分子的辨别能力较低),而磁共振质谱仪(MALDI-MRMS)则具有较高的测量精度和质量分辨能力。

MALDI 成像在制药研发与癌症研究中的应用

在整个2000年代,MALDI 成像沿着两条平行的轨道发展:作为生物学家的一种研究工具,人们的兴趣持续增长;同时,有关它在药物研发(R&D)中应用的第一批材料面世。

药物研发中进行安全和有效药物风险评估的传统方法,是基于测量动物模型和人类血浆中的原型药物。然而,人们已经认识到,大多数药物靶标并不在血浆中,而其在相关组织分布的测定既要包括原型药物,还应包括其代谢物,这将将使人们对药理学和毒理学有更多的了解。

定量全身放射自显影(QWBA)和液相色谱联用质谱(LC-MS)是研究药物在体内分布的最佳实践方法,而他们现在明显将重点放在分析组织而不是血浆上,但仍未能提供完整的结果。这两种技术都存在挑战。QWBA是一种稳健的方法,所产生的数据被世界各地的监管机构所接受。但是,它需要使用放射性标记探针,并呈现出体内总放射性物质的总和,包括原型药物、代谢物、杂质和降解产物的各种组合。

LC-MS分析的对象是组织匀浆提取物。这项技术不能提供任何空间信息,更重要的是,它可能会产生误导。例如,如果组织中的被分析物高度局部化,提取和均质过程将起到稀释作用,从而掩盖这种分布,并使浓度相对较低,有时甚至低于检测极限。

在此背景下,MALDI成像为药物开发提供了潜在的优势。例如,MALDI成像能提供药物及其重要代谢产物在组织样本中定位的重要新信息。图2突出显示了S.Castelinoet 等于2011年发表的早期工作[3]:通过放大,可以找出组织切片中的炎症区域。对应于相同放大区域的MALDI成像图(50μm空间分辨率)表明,拉帕替尼代谢物M10只出现在炎症相关的区域。


图2:犬肝脏切片组织学和MALDI成像的相关性

此外,MALDI成像技术也有助于开发新的疾病生物标志物,特别是在癌症研究领域。在这里,癌症样本的异质性意味着,由于样本的空间分布和组织学信息得到保留,MALDI成像非常适合这项工作。重要的是,MALDI成像已经成功地应用于检测癌症中先前未知的蛋白质,以及在蛋白质N-和O-糖基化的生物标志物发现方面的最新进展。在这类研究中,MALDI成像已被用于开发肿瘤特异性聚糖生物标志物,这些标志物有望在癌症组织中表征N-连接聚糖[4]。

仪器的进步推进了生物学的新前沿

重要的是,尽管MALDI成像与制药的关联最为人所知,但MALDI成像的药物应用仅包括早期采用该技术的一个领域。大约在制药行业初步工作开始的同时,法国的几个研究所正在使用MALDI技术来深入了解环境毒素对粮食供应中的再生产、化学相互作用和结构的影响,并评估为污染土地的生物修复而设计的植物。

其中一个由Charles Pineau领导的研究小组,一直在使用MALDI成像技术,并将其应用于研究发育和生殖生物学、环境以及化学毒性。Pineau是Inserm(法国国家健康与医疗研究所)的研究总监,同时也是IRSET(环境与职业健康研究所)的团队负责人。作为他在IRSET的职责的一部分,他也是Protim实验中心的总监,Protim实验中心涉及优化和验证蛋白质组学中两个领域的新技术:复杂样品的蛋白质组深度表征,以及毒理学和临床MALDI成像。

协作推动卓越成像

Protim参与了欧盟资助的两个合作项目:“3D MASSOMICS”和“METASPACE”

最近完成的研究项目“3D-MASSOMICS”是欧盟FP7健康计划的一部分,旨在利用MALDI成像技术实现3D无标记蛋白质组学和代谢组学成像[5]。传统的三维成像技术如CT、MRI和PET不能用于蛋白质组学和代谢组学发现研究,也不能用于生物标志物发现和疾病途径分析。为了应对这一重大挑战,该联盟联合了来自6个国家和地区的工业和研究领域的9个合作伙伴,包括Protim,开发可重复采集3D MALDI成像数据的统计方法,以及对该数据进行有监督(或无监督)的统计分析和解释。

该联盟协调人Palmer和Alexandrov[6]进行的审查,旨在评估并增强分析领域对3D质谱成像的认识,和加速该分子成像工具的创新。审查结果表明,缩短采集时间对三维质谱成像的发展具有重要意义。当采用快速质量分析器(如TOF或QTOF技术)以及2-5 kHz的高频激光器时,要求高加速、高精度定位的逐像素数据采集方法成了瓶颈。据报道,先进的高性能质谱成像系统使用5-40 kHz激光器,提供每秒20像素的采集速度。

作为欧盟Horizon 2020研究和创新计划的一部分,METASPACE是Protim正在进行的一个项目[7]。它是一个专门的平台,承载MALDI成像数据的代谢物注释引擎,整合了学术界提供的数百个公共数据集的空间代谢物知识库。METASPACE平台由欧洲分子生物学实验室(EMBL)Alexandrov团队的软件工程师、数据科学家和质谱专家开发。作为该项目的一部分,成像质谱法被应用于空间代谢组学分析,目的是在高质量分辨率质谱成像中创建一个用于自动代谢产物注释的生物信息学工具[8]。已建立起一种可有效挖掘10 - 100 GB数据集的算法,注释结果如图3所示。


图3:显示三组来自大鼠脑冠状部的MALDI FTICR成像数据集的FDR控制分子注释(HMDB, FDR 期望值 = 0.1):a)维恩图显示了已注释的分子数和在三个数据集中都注释的的十个分子;b)四个注释的分子的质谱成像图(全部十个注释分子的详细信息参见表SD1.2),以及FDR曲线:f)与单独考虑的精确质量滤波和空间混沌测量相比,MSM的优越性,以及g)采用较大m/z公差信号模拟退化的质量精度和分辨率时,分子注释可靠性降低。(补充数据 2,〔8〕)

有关人十氯酮暴露的分析

除了3D-MASSOMICS和METASPACE项目,Pineau的研究小组在Protim还有许多活跃的项目,研究接触环境中的化学物质对人体健康的影响。传统上,来自美国环境保护署(US EPA)和其它官方机构的限制和指导原则规定了可接受的有毒化学品环境水平。根据毒素类型和基质(如空气、水或土壤)的不同,分别采用专用的环境化学方法(ECM)检测以符合上述限制,如气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。通常与电子捕获检测器(ECD)方法一起使用(所有技术与ECM方法的完整列表可在 [9] 中找到)。然而,这些数据并未揭示出这些物质在环境中可能对人类健康产生的潜在影响及其机制。

法国Rennes(雷恩)的几个IRSET小组正在分析杀虫剂十氯酮。直到1993年,这种杀虫剂一直在Martinique(马提尼克)和Guadeloupe(瓜德罗普)用来对付香蕉象鼻虫。十氯酮是一种已知的内分泌干扰物和致癌物,自1990年起在世界范围内禁止使用。在禁令实施之前,法属西印度群岛有相当一部分人口暴露于该化学物质,土壤和沿海水域也受到污染。

流行病学家Luc Multigner(IRSET研究所的一名小组负责人)2010年发表于Journal of Clinical Oncology(《临床肿瘤学杂志》)上的初步研究证实,十氯酮能显著增加患前列腺癌的风险,这正是两个岛上一半的癌症患者为前列腺癌的原因[10]。同时,Protim的团队正在开发新的激光技术来提高MALDI成像的分辨率。2011年的一份突破性研究成果首次表明,有可能在商用仪器上以20微米的分辨率获取10 kDa范围内蛋白质的MALDI图像[11]。以大鼠睾丸为相关模型,证明该分辨率得到的质谱成像与细胞水平上的复杂解剖特征相符。分子信号与生精上皮内生殖细胞的发育建立起了良好的相关性。

这种灵敏度水平被认为对于下一阶段十氯酮研究、以及研究十氯酮在体内的定位并直接在组织样本上定量十分关键。开发小分子毒理学评价的MALDI成像技术需要可靠定量方法。然而,有几个因素决定了MALDI成像定量分析十分复杂。首先,组织切片中的内源性物质会影响感兴趣离子的强度,并可能导致在整个切片的不同位置的电离效率不同。第二,基质结晶的异质性会引起信号的变化。最后,根据所研究分子的理化性质和基质溶液组成的不同,在喷洒基质的过程中产生的感兴趣化合物的提取效率会有所不同。

Pineau的团队能够开发一种强有力的方法,直接在组织切片上进行原位定量,结果发表于2014年[12]。图4显示了在十氯酮和CCl4处理的小鼠肝脏病理切片中得到证实的十氯酮原位绝对定量结果(ISAQ)。


图4:十氯酮和CCl4处理小鼠肝脏病理切片中十氯酮的原位绝对定量。(A)H&E染色显微图像。(B)对应于十氯酮水合物的MALDI成像:在分析区域内测得十氯酮的平均绝对量为355 μg/g。(C)在各个坏死区域测得的局部绝对量低于在健康组织的测量值(381 μg/g)。组织切片上内标(m/z 516.71)的均匀分布证实了十氯酮的差异分布并非由于离子抑制效应所致。

该小组成功地开发了一种通过MALDI成像定量小分子的方法,它基于将标记归一化与MALDI成像和气相色谱相关曲线的计算作为常规定量技术。该方法已成功地应用于小鼠肝脏中十氯酮的定量分析,是MALDI成像应用于组织中杀虫剂定量分析的第一例。

虽然这项研究是MALDI成像能力的重要进步,但由于十氯酮的半衰期为30年,因此Guadaloupe的环境污染预计还将持续500余年。科学家继续监测岛屿上的不同人群,以评估十氯酮对男性生育能力、儿童发育和行为的持续影响。例如,关于接触十氯酮对妊娠期和早产风险的影响的研究发现。无论何种分娩方式(自发或诱发),母体接触十氯酮与妊娠期较短和早产风险增加密切相关。十氯酮的激素、雌激素和孕激素特性被认为是导致这种联系的原因[13]。

利用3D成像提高精子形成的知识

除了对十氯酮和其它有毒化合物(例如双酚A和草甘膦)影响的研究外,Pineau和Protim团队还为MALDI成像在人类生殖生物学中的更广泛应用做出了贡献。Pineau拥有30多年的经验,是精子形成方面的著名专家。他为蛋白质组学和综合蛋白质组学技术的发展、及其在睾丸病理生理学和生殖毒理学应用领域中解答生物学和临床相关问题方面作出了重要贡献。现在,MALDI成像在他进一步研究精子成熟的复杂过程中起着关键作用。

附睾是位于睾丸旁的一个小器官。睾丸内形成的未成熟精子,形态完整,但缺乏功能。配子通过附睾传递,在成熟过程中获得动力和受精能力。核基因转录在精子成熟阶段被关闭。因此这个过程是由一系列与复杂的附睾管腔微环境密不可分的连续蛋白质修饰所驱动的。在精子经历从头段到尾段的过程中,其子域发生了许多生化事件,包括翻译后修饰、蛋白水解过程、蛋白质重新分布和消散、新成分的整合,从而导致精子表面的动态重塑。

MALDI成像在原位显示分子的独特能力,大大促进了对这一复杂生物学的研究,使之比以往任何时候都更容易获得。图5显示了大鼠附睾头部的2D MALDI成像图,显示的一些多肽可能与精子在通过器官过程中的成熟有关[14];图6展示了Pineau的实验室的最新工作——3D MALDI成像图的创建[15]。构建一个器官的3D MALDI成像模型的过程始于在该器官上制作数百(或数千)个切片。对每一部分进行测量,将数据在软件中组合起来,以生成最终的图像。产生的数据集很大(达到TB水平),但一旦完成,数据集就能被用于信息挖掘,可使用多年。


图5:MALDI成像质谱法测定大鼠附睾精子转运的分子图像。可以同时棋牌游戏可以赚钱吗到在附睾转运过程中与精子成熟的相关的许多多肽。分别以不同的颜色显示了三种与特异性多肽,m/z 5470、6177和18746,相对应的信号叠加。必须使用80微米的横向图像分辨率来解析器官结构。


图6:大鼠附睾头部3D质谱成像图。有限质量范围(m/z 250至m/z 1650)的SCiLS软件中的PLSA计算。左:m/z对应于血管输出区的代谢物。右:m/z对应于沿小管显现的代谢物。

总结

MALDI成像已经成为一种可提供深入了解组织中多肽、蛋白质和小分子局部分布的技术。应用范围涵盖基础生物学研究、环境和毒理学科学,以及专门的药物研发方法。在每一种情况下,MALDI成像所产生的独特信息对理解各种重要因素,如分子和代谢机制,以及人类、动植物物种的化合物或代谢物的转运和定位,都能作出重要贡献。正如本文所强调的,MALDI成像还可以显示十氯酮等杀虫剂如何长期影响人类健康,并为环境立法以及有关补救和环境政策的政治和经济决策提供支持性证据。可以说,MALDI成像系统的不断改进使其更易获得、更可靠和更易于使用,数据分析变得更加复杂和自动化——MALDI成像在未来几年将发挥越来越重要的作用。

鸣谢

这项工作部分得到了以下人士的支持:Charles Pineau博士,Inserm研究主管和Protim中心实验室总监;Richard M. Caprioli,田纳西州纳什维尔Vanderbilt大学医学院生物化学、化学、药理学和医学系教授;Hélène Rogniaux博士,法国国家农业研究所(INRA)生物聚合物、相互作用、组装(BIA)研究工程师;以及Dimitri Heintz博士,法国斯特拉斯堡的成像质谱平台PIMS代谢组学实验室(IBMP)负责人。

参考文献

1. Caprioli RM, Farmer TB and Gile J. Molecular Imaging of Biological Samples:  Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS, Anal. Chem. 1997; 69 (23): 4751–4760.

2. Lagarrigue M, Caprioli RM and Pineau C. Potential of MALDI imaging for the toxicological evaluation of environmental pollutants,J. Proteomics. 2016; 144: 133-139.

3. Castellino S, Groseclose MR, Wagner D. MALDI imaging mass spectrometry: bridging biology and chemistry in drug development,Bioanalysis. 2011; 3(21): 2427-2441.

4. Kailemia MJ, Xu G, Wong M, Li Q, Goonatilleke E, Leon F and Lebrilla CB. Recent Advances in the Mass Spectrometry Methods for Glycomicsand Cancer, Anal. Chem. 2018, 90, 208−224.

5. 3D-MASSOMICS, University of Bremen,https://eu3dmassomics.uni-bremen.de

6. Palmer AD, Alexandrov T.Serial 3D imaging mass spectrometry at its tipping point, Anal. Chem. 2015, 87, 4055-62.

7. METASPACEhttps://metaspace2020.eu/#/about

8. Palmer A, Phapale P, Chernyavsky I, Lavigne R, Fay D, Tarasov A, Kovalev V, Fuchser J, Nikolenko S, Pineau C, Becker M and Alexandrov T. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry, Nature Methods. 2017, 14, 57–60.

9. Environmental Chemistry Methods (ECM), Analytical Methods and Procedures for Pesticides, United States Environmental Protection Agency (https://www.epa.gov/pesticide-analytical-methods/environmental-chemistry-methods-ecm-index-0-9)

10. Multigner L, Ndong JR, Giusti A, Romana M, Delacroix-Maillard H, Cordier S, Jégou B, Thome JP, Blanchet P. Chlordecone exposure and risk of prostate cancer. J. Clin. Oncol. 2010; 28(21): 3457-3462.

11. Lagarrigue M, Becker M, Lavigne R, Deininger S-O, Walch A, Aubry F, Suckau D, Pineau C. Revisiting rat spermatogenesis with MALDI imaging at 20 um resolution. Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10(3): M110.005991.

12. Lagarrigue M, Lavigne R, Tabet E, Genet V, Thomé JP, Rondel K, Guével B, Multigner L, Samson M, Pineau C. Localization and in Situ Absolute Quantification of Chlordecone in the Mouse Liver by MALDI Imaging. Anal. Chem. 2014; 86: 5775−5783.

13. Kadhel P, Monfort C, Costet N, Rouget F, Thomé JP, Multigner L, Cordier S. Chlordecone exposure, length of gestation and risk of preterm birth. Am. J. Epidemiol. 2014; 179(5): 536-544.

14. Protimhttps://www.protim.eu/index.php/en/

15. Lavigne et al. in preparation.

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